Erythropoietin (EPO) - Nachweis

Der aktuelle EPO-Nachweis, den die Welt Anti-Doping Agentur (WADA) zulässt, besteht aus einem direkten Nachweis von EPO im Urin bzw. im Blut.

Gentechnisch hergestellte EPO-Präparate (rekombinantes EPO) unterscheiden sich vom EPO (endogenes EPO), das im menschlichen Organismus synthetisiert wird, durch eine hohe Heterogenität in den Zuckerketten. Hierbei sind Unterschiede in der Verzweigungsvielfalt der Ketten, der Anzahl an endständigen Sialinsäuregruppen sowie an Sulfatgruppen bekannt.

Darüber hinaus existieren rekombinante EPO-Präparate, die Unterschiede in der Aminosäuresequenz (z.B. Darbepoetin) aufweisen bzw. zusätzlich pegyliert (Bindung mit Polyethylenglycol) sind (z.B. CERA). Diese Unterschiede können durch elektrophoretische Trennsysteme analytisch ausgenutzt und zu einer Differenzierung zwecks Dopingnachweis verwendet werden.

Bei den elektrophoretischen Methoden kann entweder die IEF-Methode (Isoelektrische Fokussierung), die erstmals von Francoise Lasne für die Dopinganalytik eingeführt wurde, verwendet werden, oder die SDS-PAGE bzw. SAR-PAGE-Methode. Letztere beide Methoden trennen die unterschiedlichen EPO-Formen nach Molekülgrößen auf.

SDS-PAGE ist die Abkürzung für englisch: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SAR-PAGE ist die Abkürzung für englisch: sarcosyl polyacrylamide gel electrophoresis

PDF-Download: Urin-IEF-Methode

Literatur

Lasne F and de Ceaurriz J. Recombinant erythropoeitin in urine. Nature, 405 (2000) 635
Artikel in Nature

Lasne F(1), Martin L, Crepin N, de Ceaurriz J. Detection of isoelectric profiles of erythropoietin in urine: differentiation of natural and administered recombinant hormones. Anal Biochem. 2002 Dec 15;311(2):119-26.
Abstract  

Reichel C, Abzieher F, Geisendorfer T. SARCOSYL-PAGE: a new method for the
detection of MIRCERA- and EPO-doping in blood. Drug Test Anal 1(11-12): 494-
504 (2009)
Abstract

Reichel C. SARCOSYL-PAGE: A New Electrophoretic Method for the Separation
and Immunological Detection of PEGylated Proteins. Methods Mol Biol. 869:65-
79 (2012)
Abstract

Reichel C., Gmeiner G. (2010) Erythropoietin and Analogs. In: Thieme D., Hemmersbach P. (eds) Doping in Sports: Biochemical Principles, Effects and Analysis. Handbook of Experimental Pharmacology, vol 195. Springer, Berlin, Heidelberg 
Abstract

IEF-Gel (Beispiel)

Lane 1 - NIBSC (urinäres EPO)
Lane 2, 7, 12, 17 - EPO Referenz Standards BRP und NESP (Darbepoetin)
Lane 3 bis 6, 8 bis 11, 16, 19 bis 21  - negative Dopingkontrollproben
Lane 13 - positiver QC (Qualitätskontrolle, EPO RefStd BRP zugesetzt zu einer Urinprobe)
Lane 14 - positive Dopingkontrollprobe (AAF, Adverse Analytical Finding)
Lane 15 - negativer QC (Qualitätskontrolle)
Lane 18 - Stabilitätstest mit den EPO Referenz STDs BRP und NESP

Interpretation der Ergebnisse

Der Ausschnitt auf der rechten Seite zeigt die Proben der Lane 12 bis 15 des obigen IEF-Gels. In der  Lane 14 wird eine positive Dopingkontrollprobe analysiert. Zur Bewertung der Ergebnisse wird unterhalb der untersten Bande des EPO-Referenz Standards BRP (Lane 2, 7 ,12 ,17) eine Linie (rot) über das gesamte Gel gelegt. Der Bereich unterhalb der roten Line wird als endogener Bereich (endogenous) sowie saurer Bereich (acidic, blaue Linie) und der Bereich oberhalb der roten Linie als basischer Bereich (basic) bezeichnet. Wenn mindestens zwei der Banden oberhalb der roten Linie (basischer Bereich) intensiver sind als die intensivste Bande im endogenen Bereich, dann wird die Probe positiv bewertet. Die Auswertung erfolgt entsprechend dem Technischen Dokument der WADA TD2014EPO.

SAR-PAGE (Beispiel)

Interpretation der Ergebnisse

Für die Interpration der Ergebnisse wird das Rohdatenfile mit einem zertifizierten Auswertprogramm (GASEPO) verarbeitet, wobei alle Banden kontrastoptimiert werden. Durch die Dynepo Referenz Standards wird eine Linie (blau) über das gesamte Gel gelegt. Alle negative Proben zeigen Signale unterhalb dieser Linie, während rekombinate EPO-Präparate ein Signal oberhalb der blauen Linie aufweisen. Bei der positiven Dopingkontrollprobe (Lane 19) wird ein sehr breites Signal sowohl oberhalb als auch unterhalb der blauen Grenzlinie detektiert. Dieses ist ein Zeichen dafür, dass neben rekombinantem EPO auch noch Anteile von endogenem (körpereigenem) EPO in der Urinprobe auffindbar sind.

SAR-PAGE - GASEPO Auswertung