Erythropoietin (EPO) ist ein Peptidhormon, das die Produktion roter Blutkörperchen stimuliert (Erythropoiese). Die erhöhte Anzahl im Organismus zirkulierender Erythrozyten hat eine Verbesserung der Sauerstoffaufnahmekapazität des Blutes und damit eine Steigerung der Ausdauerleistungsfähigkeit zur Folge. Das Internationale Olympische Komitee (IOC) verbie- tet seit ca. 12 Jahren den Gebrauch von EPO. Bis zum Jahr 2000 war der analytische Nachweis eines EPO-Missbrauchs mit der Schwierigkeit verbunden, dass das vom Organismus produzierte nicht vom synthetischen gentechnisch herge- stellten EPO zu unterscheiden war, was zur Entwicklung indirekter Nachweismethoden geführt hat. Bei indirekten Methoden zum Nachweis eines EPO-Missbrauchs werden ausgewählte Blutpara- meter (z.B. Hämatokrit, Hämoglobin, Retikulo- zyten) gemessen. Diese Blutparameter müssen folgende Eigenschaften erfüllen: 1. Zur Festlegung eines Normbereiches müssen sogenannte Referenzwerte der Parameter be- kannt sein, die aus einer möglichst großen und repräsentativen Kontrollpopulation (Non user) erhoben und statistisch ausgewertet werden. 2. Eine EPO-Applikation muss signifikante Ände- rungen der ausgewählten Blutparameter her- vorrufen, die quantitativ erfassbar sind. Das Verhalten dieser Blutparameter in Abhängigkeit von einer EPO-Applikation ist in pharmakokinetischen Studien zu untersuchen und zu charakterisieren (Parisotto et al. 2001). Indirekte Methoden haben grundsätzlich den Nachteil, dass die applizierte Substanz nicht nachgewiesen wird. Die Quantifizierung indirekter Parameter und deren Vergleich mit den Refe- renzwerten einer Kontrollpopulation birgt immer das Risiko, dass einzelne von dieser Norm abwei- chende Werte physiologische Ursachen haben können und dennoch zu einem positiven Befund führen (falsch positiver Befund). Auch der umge- kehrte Fall, in dem trotz EPO-Applikation die Blut- parameter innerhalb des Normbereiches liegen, ist möglich, was zu falsch negativen Ergebnissen führt. Die hier vorgestellte Methode zum direkten Nach- weis von rEPO wurde von Francoise Lasne aus Frankreich entwickelt (LASNE/CEAURRIZ 2000; LASNE 2001). Der direkte Nachweis von rEPO basiert auf der isoelektrischen Fokussierung (IEF) von Urinkonzentraten. Grundlage des Tests ist die Unterscheidung von humanem EPO (hEPO), das der menschliche Organismus selber synthetisiert und deshalb auch als körpereigenes bzw. endoge- nes EPO bezeichnet wird, und von rekombinantem EPO (rEPO), das gentechnisch hergestellt wird und als körperfremdes EPO zu betrachten ist. Seit November 2001 wird der Test offiziell von der Medical Commission des Internationalen Olym- pischen Komitees (Olympic Movement Anti- Doping Code) akzeptiert. Strukturmerkmale von EPO EPO ist ein Glykoprotein mit einem Molekül- gewicht von ca. 34-39 kDa. Es besteht aus insge- samt 165 Aminosäuren und 4 Zuckerseitenketten, die ungefähr 40% der Molekülmasse von EPO aus- machen. Von den Kohlenhydratseitenketten sind drei über die Aminosäure Asparagin N-glykosi- disch und eine über die Aminosäure Serin O-gly- kosidisch mit dem Protein verbunden (Abb. 1). Die Varianz des Molekülgewichts von EPO kommt durch die Heterogenität der Zuckerketten zustan- de, die endständig mit Neuraminsäurederivaten (Abb. 2) verknüpft sind. Durch unterschiedliche Längen und Verzweigungen der Ketten lässt sich eine Vielzahl von "Zuckerzweigen" konstruieren, die die Ausprägung aller Isoformen eines EPO- Moleküls bewirken (Abb. 1). Eine Übersichtsarbeit über die Strukturen von Zuckerseitenketten in 29Tanz als Spiel Fußball-Trainer EPO-Doping Handbiken Krebs und Sport Fitness-Sport Der direkte Nachweis von rekom- binantem Erythropoietin (rEPO) in Urin Ein Beitrag von Marc Machnik Bettina Bialas Wilhelm Schänzer Institut für Biochemie Abb. 1: Schematische Darstellung von Erythropoietin. EPO wurde von C.H. HOKKE (1995) veröffentlicht. Da die Glykosilierung von Proteinen speziesspezifisch erfolgt, unter- scheidet sich das Glykosilie- rungsmuster in humanem EPO vom rekombinan- ten EPO anderer Tierspezies, z.B. vom EPO des Hamsters. CHO-Zellen (Chi- nese Hamster Ova- ry) bilden zur Zeit die Hauptquelle für r e k o m b i n a n t e s EPO. Beim rekom- binanten EPO ist die Neuraminsäure zu etwa 95% am Stickstoff acetyliert (= Sialinsäure) und ca. 2% liegen als Glykolylacetyl-Derivat vor (Abb. 2). Der Grad dieser unterschiedlichen Acetylierung und auch die An- und Abwesenheit sogenannter Repeats (immer wiederkehrende Zuckereinheiten) sind verantwortlich für unterschiedliche isoelek- trische Punkte (pI) von humanem und rekom- binantem EPO. Diese Eigenschaft wird analytisch bei der isoelektrischen Fokussierung (IEF) zum EPO-Nachweis ausgenutzt. Isoelektrischer Punkt (pI) und iso- elektrische Fokussierung (IEF) Isoelektrische Punkte treten bei Ampholyten auf, also bei Molekülen, die sowohl eine basische als auch eine saure Gruppierung enthalten. Einfaches Beispiel für Ampholyte sind Aminosäuren. Amino- säuren können sich aufgrund ihrer funktionellen Gruppen positiv, negativ oder neutral verhalten, abhängig vom pH-Wert des umgebenden Me- diums. Bei einem bestimmten pH-Wert liegt das Molekül voll ionisiert vor (Zwitterion), trägt aber in der Summe keine elektrische Ladung. Dieser pH wird als isoelektrischer Punkt bzw. pI bezeichnet (Abb. 3). Proteine, die aus Aminosäuren aufgebaut sind, verhalten sich ähnlich. Außer Säure- und Amino- gruppen beeinflussen auch anderer Struktur- elemente den pI eines Moleküls, z.B. in EPO die Kohlenhydratseitenketten. Der pI ist somit ein charakteristisches Merkmal eines Proteins. Eine Methode, um Proteine nach ihren isoelektri- schen Punkten zu trennen, ist die Elektrophorese (LASNE 2001), hier im speziellen die isoelektrische Fokussierung (IEF). Sie basiert auf der Eigenschaft geladener Proteine, in einem elektrischen Feld zur entgegengesetzt geladenen Elektrode zu wan- dern. Bei der IEF wird in einem Trennmedium, was praktischerweise ein Gel ist, ein stabiler pH- Gradient erzeugt. Die Protein-Mischung wird auf das Gel pipettiert und nach Anlegen eines elektri- schen Feldes wandern die Proteine bis zu dem pH, der ihrem pI entspricht. Bei pH = pI gilt, dass die Nettoladung 0 ist und die Proteine zum Stillstand kommen. Diffundieren die Proteine aus der Zone ihres pI heraus, erhalten sie erneut eine Ladung und werden sozusagen zurückfokussiert (Abb. 5). Daher der Begriff isoelektrische Fokussierung. Probenaufarbeitung und Analyse Die Probenvorbereitung des Urins zur EPO-Be- stimmung beinhaltet eine Mikrofiltration sowie 30 Fitness-Sport Krebs und Sport Handbiken EPO-Doping Fußball-Trainer Tanz als Spiel Abb. 3: Abhängigkeit der Netto- ladung einer Aminosäu- re (Glycin) vom pH- Wert. Der pK1-Wert entspricht dem pH-Wert, bei dem die obige Aminosäure zur Hälfte eine positive Ladung trägt (+NH3-CH2- COOH) und zur anderen Hälfte als neutrales Mo- lekül mit einer positiven und einer negativen La- dung (+NH3-CH2-COO-) vorliegt. Bei pH = pK2 bildet sich ein äquimo- lares Gleichgewicht (gleiche Anzahl von Mo- lekülen) zwischen der Neutralform und der ne- gativ geladenen Vari- ante (NH2-CH2-COO-) aus. Abb. 4: Abhängigkeit der Nettoladung eines Proteins vom pH-Wert. Man beachte, dass Moleküle bei pH-Werten oberhalb ihres pI negativ und bei pH-Werten < pI positiv geladen sind. Abb. 5: Isoelektrische Fokussierung (IEF). Abb. 2: Derivate der Neuramin- säure. R=H=Neuraminsäure; R=COCH3=Sialinsäure; R=COCH2OH=N-Glyco- lylneuraminsäure. zwei Ultrazentrifugationsschritte und ist im Ergeb- nis lediglich eine Konzentrierung der im Urin ent- haltenen Proteine. Nach der Urinkonzentrierung folgt die Trennung von humanem und rekombinan- tem EPO mittels IEF in einem Polyacrylamid-Gel mit geeignetem pH-Gradienten. Die EPO- Isoformen werden durch Anlegen eines elektri- schen Feldes gemäß ihrer pI getrennt. Der Elektrophorese schließt sich ein sogenannter Immunoblot (Immuno-Abdruck) an, bei dem die urinären Proteine auf eine bestimmte Membran (z.B. aus Polyvinylidenfluorid, PVDF) überführt werden. Man erhält so ein Abbild der einzelnen EPO-Banden auf der Oberfläche der PVDF- Membran. Diese Membranen haben den Vorteil, dass sie Proteine (hauptsächlich durch hydropho- be Wechselwirkungen) sehr stark fixieren und sich ansonsten chemisch neutral verhalten. Dadurch, dass sich die EPO-Moleküle an der Membranoberfläche befinden, sind sie leicht zugänglich für Antikörper, die dazu dienen, die EPO-Banden sichtbar zu machen. Zunächst wird ein monoklonaler Anti-EPO- Antikörper (MAK) auf die PVDF-Membran verteilt, der spezifisch an alle vorhandenen EPO-Moleküle bindet, sowohl an rEPO wie hEPO. Andere urinäre Proteine reagieren nicht mit dem Antikörper. Nicht an EPO gebundene MAK können von der Membran gewaschen werden, weil die restliche PVDF-Oberfläche zuvor mit einem unspezifischen Protein (Rinderserumalbumin RSA, Milchpulver- lösungen etc.) blockiert wurde (Abb. 6). Wichtig für den Immunoblot ist der Einsatz hochspezifi- scher MAK gegen EPO. Sobald Kreuzreaktionen zu anderen urinären Bestandteilen stattfinden, ist der Test nicht auswertbar. Die Bindung des Antikörpers an EPO ist reversi- bel, weil sie auf nicht kovalenten Wechsel- wirkungen beruht, und kann so z.B. durch pH- Veränderung rückgängig gemacht werden. Im sauren Milieu ändert der Antikörper die Konfor- mation seiner Bindungsdomäne und beim Anlegen eines elektrischen Feldes dissoziiert der MAK vom EPO-Molekül ab in Richtung Kathode, wo er an eine zweite PVDF-Membrane gebunden wird (Abb. 7). Die EPO-Moleküle sowie andere nicht spezifische urinäre Proteine verbleiben auf der 1. Membran, da die Bindung zu PVDF durch pH- Schwankungen nicht beeinflusst wird. So erhält man ein erneutes Abbild der einzelnen EPO-Banden. Allerdings befinden sich auf der 2. Membran keine EPO-Moleküle, sondern die spezi- fischen monoklonalen Antikörper (MAK). Die Sichtbarmachung der Antikörperbanden er- folgt durch einen zweiten Antikörper (Se- kundärantikörper), der mit dem Anti-EPO-MAK reagiert. Dieser sekundäre Antikörper ist mit spe- ziellen Enzymen gekoppelt (z.B. alkalische Phos- phatase oder Peroxidase), die eine Substrat- umwandlung katalysieren, bei der Chemilumines- zens entsteht. Der Vorteil des zweiten Blots ist die Reduktion des biologischen Untergrundes, da der enzymmarkier- te Sekundärantikörper keine unspezifischen Re- aktionen zu anderen Urinbestandteilen auf der 1. Membran eingehen kann. Außerdem ist eine Sig- nalverstärkung und eine damit verbundene Erhöh- ung der Empfindlichkeit durch Mehrfachbindung der Antikörper-Enzym-Konjugate an den ersten Antikörper (MAK) denkbar. Bei der Chemilumineszensreaktion wird ein spezi- elles Substrat oxidiert und dadurch in einen ener- getisch angeregten Zustand versetzt. Der entste- hende Acridiniumester geht unter Aussendung von Licht in einen stabileren Zustand über (Abb. 9). Das emittierte Licht wird mit einer Spezialkamera gemessen und computer-gestützt ausgewertet. Abb. 10 zeigt ein schematisches Bandenmuster einzelner EPO-Isoformen nach Entwicklung mit- tels einer CCD-Kamera (Charge Coupled Device). Rekombinantes EPO befindet sich in einem Bereich höherer pH-Werte, woraus folgt, dass es aus basischen Isoformen besteht (Spalte A). Spal- te B enthält humanes EPO, welches niedrigere pI- Werte aufweist. 33Tanz als Spiel Fußball-Trainer EPO-Doping Handbiken Krebs und Sport Fitness-Sport Abb. 6: Prinzip eines Immuno-Blots. Abb. 7: Prinzip des zweiten Blottings. Abb. 8: Visualisierung der MAK-Banden. S =Substrat, E = Enzym, P = Produkt. Zur Unterscheidung von rekombinantem und hu- manem EPO dient ein Wert, der saure von ba- sischen Isoformen abgrenzt. Die Festlegung die- ses Grenzwertes (Cut off) orientiert sich an der Bande des rekombinanten EPO mit dem niedrig- sten pI (hier untere Bande der Spalte A). Zusammenfassung und Ausblick Der direkte Nachweis von rekombinantem EPO basiert auf der isoelektrischen Fokussierung in einer Polyacrylamid-Gelmatrix mit pH-Gradient. Dabei werden humane und rekombinante EPO- Moleküle in einem elektrischen Feld voneinander getrennt. Fixierung sowie Visualisierung der ein- zelnen Epo-Banden erfolgen durch einen zweifa- chen Immunoblot, bei dem zuerst die EPO-Mole- küle auf eine PVDF-Membran transferiert und durch spezifische Antikörper markiert werden. Anschließend werden die spezifischen Antikörper auf einer zweiten PVDF-Membran abgebildet und mittels einer Chemilumineszens-Reaktion sichtbar gemacht. Die mit einer Spezialkamera aufgenom- menen Bandenmuster zeigen, dass humanes EPO niedrigere pI-Werte aufweist als rekombinantes, welches aus basischeren Isoformen besteht. Das hier vorgestellte Verfahren eignet sich auch zum Nachweis neuer EPO-Präparate wie Darbepoetin bzw. NESP (Novel Erythropoiesis Stimulating Protein, Handelsname in den USA: Aranesp), da sich die pI-Werte von humanem EPO und NESP voneinander unterscheiden. Grenzen der Methode sind in der aufwendigen und diffizilen Probenbehandlung zu sehen, die die Re- produzierbarkeit von Messergebnissen beeinträch- tigen kann. Aufgrund der sehr geringen Dosierung von EPO sind auch die zu erwartenden Urinkonzen- trationen äußerst gering, weshalb bis dato andere theoretisch mögliche Nachweismethoden wie z.B. LC/MS-Verfahren (Flüssigkeitschromatographie /Massenspektrometrie) und elektrophoretische Verfahren mit MS-Kopplung aufgrund ihrer unzurei- chenden Empfindlichkeit nicht zum Einsatz gekom- men sind. Ansatzpunkte für eine Verbesserung der Empfindlichkeit können spezifische Isolierungs- und Aufkonzentrierungsverfahren für EPO sein, wie z.B. die Immunoaffinitätschromatographie. Literatur bei den Autoren. Glossar Ampholyt Verbindung, die sowohl sauer als auch basisch reagieren kann. Amphotere Verbindung siehe Ampholyt. Antigen Substanz, die von einem Organismus als fremd erkannt wird und dadurch eine spezifische Im- munantwort (Bildung von Antikörpern) auslöst. Antikörper Klasse von Proteinen, die als Antwort des Immun- systems nach Kontakt des Organismus mit einem Antigen (Fremderreger) gebildet werden und mit dem entsprechenden Antigen spezifisch reagie- ren. Blot Verfahren, elektrophoretisch aufgetrennte Prote- ine auf eine bestimmte Membran zu transferieren und zu immobilisieren. CHO Abkürzung für Chinese Hamster Ovary, Quelle für eine in der Gentechnologie vielfach genutzte Zell- linie, die aus dem Ovar einer chinesischen Hams- terart stammt. Erythropoiese Bildung und Reifung von Erythrozyten, Regulie- rung durch EPO. Glykoprotein Protein mit einem kovalent gebundenen Kohlen- hydratanteil. Glykosilierung Knüpfung einer glykosidischen Bindung (z.B. an Proteine), siehe auch N-/ O-glykosidische Bin- dung. 34 Fitness-Sport Krebs und Sport Handbiken EPO-Doping Fußball-Trainer Tanz als Spiel Abb. 9: Prinzipielle Abläufe bei der Chemilumineszens. S = Substrat, E = Enzym, P = Produkt, HRP = Hor- seradish peroxidase. Abb. 10: EPO-Banden nach IEF, Doppel-Blot und Chemilumineszens- Visualisierung. A = rekombinantes EPO aus einem Standard- präparat; B = humanes EPO aus einer negativen Urinprobe; C = rekom- binantes EPO aus einer positiven Urinprobe (vgl. LASNE et al. 2000). hEPO humanes, körpereigenes Erythropoietin HRP Abkürzung für Horseradish Peroxidase. Enzym, das Oxidationsreaktionen katalysiert. Isoelektrische Fokussierung Verfahren zur Trennung von geladenen Makro- molekülen in einem elektrischen Feld mit pH- Gradienten. Isoelektrischer Punkt Bezeichnung für denjenigen pH-Wert einer Lö- sung eines Ampholyten, bei dem seine Netto- ladung gleich null ist. Am isoelektrischen Punkt besteht keine Wanderung im elektrischen Feld. Isoformen von EPO EPO-Moleküle, die sich nur innerhalb der Zuckerseitenketten unterscheiden. MAK Abkürzung für monoklonaler Antikörper. Monoklonaler Antikörper von einem einzigen Zellklon ausgehende homoge- ne und monospezifische Antikörperpopulation. Neuraminsäure Polyhydroxyaminoketosäure, Bestandteil von Gly- koproteinen, trägt zur negativen Ladung der Pro- teine bei. N-glykosidische Bindung Bindungsart, bei der die Hydroxylgruppe eines Saccharids mit dem Stickstoffatom eines Re- aktionspartners (z.B. Protein) unter Wasserab- spaltung reagiert. O-glykosidische Bindung Bindungsart, bei der die Hydroxylgruppe eines Saccharids mit dem Sauerstoffatom eines Re- aktionspartners (z.B. Protein) unter Wasserab- spaltung reagiert. pKA negativer dekadischer Logarithmus der Dis- soziationskonstanten einer Säure. pH pondus hydrogenii, negativer dekadischer Loga- rithmus der Wasserstoffionenkonzentration. Repeats wiederkehrende Zuckereinheiten. rEPO rekombinantes, körperfremdes Erythropoietin Zwitterion Zustand einer amphoteren Verbindung, bei dem die Dissoziation der basischen und sauren Gruppe gleich stark und damit die Summe der Ladungen gleich null ist. 35Tanz als Spiel Fußball-Trainer EPO-Doping Handbiken Krebs und Sport Fitness-Sport Dr. Marc Machnik, geb. 1968 in Grevenbroich, studierte Chemieingenieurwesen mit Fachrich- tung Biotechnologie an der FH Aachen. Im Febru- ar 2000 promovierte er an der Deutschen Sport- hochschule Köln in den Fächern Biochemie und Trainings- und Bewegungslehre. Seit März 2000 ist er wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Biochemie. E-Mail: m.machnik@biochem.dshs-koeln.de